|
|
Úloha fosforylace proteinů v progamické fázi vývoje samčího gametofytu tabáku
Fíla, Jan ; Honys, David (vedoucí práce) ; Paleček, Jan (oponent) ; Smýkal, Petr (oponent)
Zralý pyl tabáku obsahuje silně dehydratovanou cytoplazmu a je metabolicky neaktivní. Po rehydrataci cytoplazmy je jeho metabolizmus nastartován a po dokončení aktivace vyrůstá pylovou aperturou pylová láčka. Změny v zavodnění cytoplazmy spolu s nastartováním metabolizmu jsou doprovázeny regulací translace i post-translačních modifikací (zejména fosforylace) přítomných proteinů. V této disertační práci jsou prezentovány fosfopeptidy ze zralého pylu tabáku virginského (Nicotiana tabacum), pylu aktivovaného in vitro 5 min a pylu aktivovaného in vitro 30 min. Z každého stádia byl získán celkový proteinový extrakt, jenž byl naštěpen trypsinem a získaná peptidová směs byla obohacena metodou MOAC (afinitní chromatografie s využitím kovového oxidu/hydroxidu) s matricí z oxidu titaničitého. Fosfopeptidy v obohaceném eluátu byly identifikovány kapalinovou chromatografií v kombinaci s tandemovou hmotnostní spektrometrií (LC-MS/MS). Celkem bylo identifikováno 471 fosfopeptidů, nesoucích 432 přesně lokalizovaných fosforylačních míst. Získané fosfopeptidy pocházely z 301 fosfoproteinů, které spadaly do třinácti funkčních kategorií. Převládajícími funkcemi se staly transkripce, syntéza proteinů, cílení a skladování proteinů a přenos signálu. Mnohé fosfopeptidy podléhaly koncentračním změnám mezi třemi...
|
|
|
Obohacovací techniky užívané ve fosfoproteomice
Fíla, Jan ; Honys, David (vedoucí práce) ; Zdráhal, Zbyněk (oponent)
Reverzibilní fosforylace proteinů patří mezi nejdynamičtější posttranslační modifikace. Fosforylace hraje důležitou roli v mnoha buněčných procesech, jmenujme např. buněčné dělení, přenos signálu, dynamiku cytoskeletu, regulaci translace, cílení proteinů a metabolizmus. Bohužel, množství fosfoproteinů v buňce často neodpovídá jejich významu, a tak pro jejich detekci bývá nevyhnutelné využít obohacovacích technik. K obohacení může dojít buď ve formě fosfoproteinů, nebo fosfopeptidů, popř. může být zvolena kombinace obou přístupů. Většina obohacovacích strategií je založena na chemické modifikaci fosfátů, afinitě fosfátu ke kladně nabité chromatografické matrici a na použití protilátek. Jednotlivé metody mají své výhody i nevýhody. Navíc kompletnějšího a spolehlivějšího odhalení fosfoproteomu lze obvykle dosáhnout až kombinací několika metod. V posledních pěti letech byly mnohé protokoly vylepšeny a další se nově objevily. Tato bakalářská práce shrnuje současné znalosti o obohacovacích metodách užívaných ve fosfoproteomice. Klíčová slova: fosfoproteomika, obohacování fosfoproteinů, obohacování fosfopeptidů, IMAC, MOAC, oxid titaničitý TiO2, hydroxid hlinitý Al(OH)3, protilátky
|
|
|
Úloha fosforylace proteinů v progamické fázi vývoje samčího gametofytu tabáku
Fíla, Jan
Zralý pyl tabáku obsahuje silně dehydratovanou cytoplazmu a je metabolicky neaktivní. Po rehydrataci cytoplazmy je jeho metabolizmus nastartován a po dokončení aktivace vyrůstá pylovou aperturou pylová láčka. Změny v zavodnění cytoplazmy spolu s nastartováním metabolizmu jsou doprovázeny regulací translace i post-translačních modifikací (zejména fosforylace) přítomných proteinů. V této disertační práci jsou prezentovány fosfopeptidy ze zralého pylu tabáku virginského (Nicotiana tabacum), pylu aktivovaného in vitro 5 min a pylu aktivovaného in vitro 30 min. Z každého stádia byl získán celkový proteinový extrakt, jenž byl naštěpen trypsinem a získaná peptidová směs byla obohacena metodou MOAC (afinitní chromatografie s využitím kovového oxidu/hydroxidu) s matricí z oxidu titaničitého. Fosfopeptidy v obohaceném eluátu byly identifikovány kapalinovou chromatografií v kombinaci s tandemovou hmotnostní spektrometrií (LC-MS/MS). Celkem bylo identifikováno 471 fosfopeptidů, nesoucích 432 přesně lokalizovaných fosforylačních míst. Získané fosfopeptidy pocházely z 301 fosfoproteinů, které spadaly do třinácti funkčních kategorií. Převládajícími funkcemi se staly transkripce, syntéza proteinů, cílení a skladování proteinů a přenos signálu. Mnohé fosfopeptidy podléhaly koncentračním změnám mezi třemi...
|
|
|
Úloha fosforylace proteinů v progamické fázi vývoje samčího gametofytu tabáku
Fíla, Jan
Zralý pyl tabáku obsahuje silně dehydratovanou cytoplazmu a je metabolicky neaktivní. Po rehydrataci cytoplazmy je jeho metabolizmus nastartován a po dokončení aktivace vyrůstá pylovou aperturou pylová láčka. Změny v zavodnění cytoplazmy spolu s nastartováním metabolizmu jsou doprovázeny regulací translace i post-translačních modifikací (zejména fosforylace) přítomných proteinů. V této disertační práci jsou prezentovány fosfopeptidy ze zralého pylu tabáku virginského (Nicotiana tabacum), pylu aktivovaného in vitro 5 min a pylu aktivovaného in vitro 30 min. Z každého stádia byl získán celkový proteinový extrakt, jenž byl naštěpen trypsinem a získaná peptidová směs byla obohacena metodou MOAC (afinitní chromatografie s využitím kovového oxidu/hydroxidu) s matricí z oxidu titaničitého. Fosfopeptidy v obohaceném eluátu byly identifikovány kapalinovou chromatografií v kombinaci s tandemovou hmotnostní spektrometrií (LC-MS/MS). Celkem bylo identifikováno 471 fosfopeptidů, nesoucích 432 přesně lokalizovaných fosforylačních míst. Získané fosfopeptidy pocházely z 301 fosfoproteinů, které spadaly do třinácti funkčních kategorií. Převládajícími funkcemi se staly transkripce, syntéza proteinů, cílení a skladování proteinů a přenos signálu. Mnohé fosfopeptidy podléhaly koncentračním změnám mezi třemi...
|
|
|
Úloha fosforylace proteinů v progamické fázi vývoje samčího gametofytu tabáku
Fíla, Jan ; Honys, David (vedoucí práce) ; Paleček, Jan (oponent) ; Smýkal, Petr (oponent)
Zralý pyl tabáku obsahuje silně dehydratovanou cytoplazmu a je metabolicky neaktivní. Po rehydrataci cytoplazmy je jeho metabolizmus nastartován a po dokončení aktivace vyrůstá pylovou aperturou pylová láčka. Změny v zavodnění cytoplazmy spolu s nastartováním metabolizmu jsou doprovázeny regulací translace i post-translačních modifikací (zejména fosforylace) přítomných proteinů. V této disertační práci jsou prezentovány fosfopeptidy ze zralého pylu tabáku virginského (Nicotiana tabacum), pylu aktivovaného in vitro 5 min a pylu aktivovaného in vitro 30 min. Z každého stádia byl získán celkový proteinový extrakt, jenž byl naštěpen trypsinem a získaná peptidová směs byla obohacena metodou MOAC (afinitní chromatografie s využitím kovového oxidu/hydroxidu) s matricí z oxidu titaničitého. Fosfopeptidy v obohaceném eluátu byly identifikovány kapalinovou chromatografií v kombinaci s tandemovou hmotnostní spektrometrií (LC-MS/MS). Celkem bylo identifikováno 471 fosfopeptidů, nesoucích 432 přesně lokalizovaných fosforylačních míst. Získané fosfopeptidy pocházely z 301 fosfoproteinů, které spadaly do třinácti funkčních kategorií. Převládajícími funkcemi se staly transkripce, syntéza proteinů, cílení a skladování proteinů a přenos signálu. Mnohé fosfopeptidy podléhaly koncentračním změnám mezi třemi...
|
|
|
Obohacovací techniky užívané ve fosfoproteomice
Fíla, Jan ; Honys, David (vedoucí práce) ; Zdráhal, Zbyněk (oponent)
Reverzibilní fosforylace proteinů patří mezi nejdynamičtější posttranslační modifikace. Fosforylace hraje důležitou roli v mnoha buněčných procesech, jmenujme např. buněčné dělení, přenos signálu, dynamiku cytoskeletu, regulaci translace, cílení proteinů a metabolizmus. Bohužel, množství fosfoproteinů v buňce často neodpovídá jejich významu, a tak pro jejich detekci bývá nevyhnutelné využít obohacovacích technik. K obohacení může dojít buď ve formě fosfoproteinů, nebo fosfopeptidů, popř. může být zvolena kombinace obou přístupů. Většina obohacovacích strategií je založena na chemické modifikaci fosfátů, afinitě fosfátu ke kladně nabité chromatografické matrici a na použití protilátek. Jednotlivé metody mají své výhody i nevýhody. Navíc kompletnějšího a spolehlivějšího odhalení fosfoproteomu lze obvykle dosáhnout až kombinací několika metod. V posledních pěti letech byly mnohé protokoly vylepšeny a další se nově objevily. Tato bakalářská práce shrnuje současné znalosti o obohacovacích metodách užívaných ve fosfoproteomice. Klíčová slova: fosfoproteomika, obohacování fosfoproteinů, obohacování fosfopeptidů, IMAC, MOAC, oxid titaničitý TiO2, hydroxid hlinitý Al(OH)3, protilátky
|
|
|
Iron oxide nanoparticle modified monolithic pipette tips for selective enrichment of phosphopeptides
Křenková, Jana ; Foret, František
We have developed iron oxide nanoparticle modified monolithic pipette tips for selective and efficient enrichment of phosphopeptides. Iron oxide nanoparticles were synthesized using a co-precipitation method and stabilized by citrate ions. A stable coating of nanoparticles was obtained via multivalent interactions of citrate ions on the nanoparticle surface with a quaternary amine functionalized surface of the methacrylate based monolithic tips. The performance of the developed and commercially available tips was demonstrated with the enrichment of phosphorylated peptides from tryptic digests of caseins followed by MALDI/MS detection.
|
host ::
RSS.